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Lutte contre la Flavobactériose par l’optimisation de la désinfection des œufs de truite

Je voudrais initier aujourd’hui une série d’articles qui auront pour but de vous exposer mes travaux dans la recherche scientifique et de rendre le tout intelligible aux visiteurs curieux sans être forcément spécialistes. Pour ce premier billet, je vais vous parler des travaux que nous avons publiés en décembre 2015 sur la flavobactériose. Avant d’en parler, je pose d’abord le contexte de travail.

Passage de la biologie végétale à l’ichtyopathologie

Depuis 2012, j’ai eu l’occasion de changer de thématique de recherche et de passer de la biotechnologie végétale et l’amélioration des qualités du fruit à la microbiologie animale, l’ichtyopathologie (ou étude des maladies des poissons). Étant donné que je me suis très rapidement spécialisé en biologie végétale lors de ma formation initiale et que j’avais alors toujours travaillé sur la laitue, le tabac mais finalement surtout sur la tomate, pour ceux qui me connaissent, cette reconversion semblait assez surprenante pour ne pas dire contre-nature.

Thème apparemment diamétralement opposé mais pas tant que ça : certes je suis « végétaliste » mais surtout biologiste moléculaire et la biologie moléculaire, ça se pratique à peu près de la même manière si on travaille sur la tomate, les virus, les bactéries, l’homme ou le pangolin. J’aurais même tendance à dire que c’est un poil plus compliqué de travailler sur les plantes et qu’extraire des acides nucléiques de truite quand on a extrait de l’ARN de feuille de fraisier, c’est aussi difficile que de se reconvertir en vigile d’une boite dans une bourgade du Massachusetts après avoir fait la guerre du Vietnam : on a tendance à sortir aussitôt l’artillerie lourde au moindre pépin alors qu’en fin de compte, il suffit de faire acte de présence pour être efficace.

Accueilli au département « Nutrition Santé et Filières Agricoles » de Bordeaux Sciences Agro

J’ai donc été accueilli à Gradignan, près de Bordeaux, dans un laboratoire de Bordeaux Sciences Agro, l’école nationale supérieur des sciences agronomiques de Bordeaux Aquitaine, anciennement appelée ENITA, tout simplement l’école d’ingénieurs agronomes de la région. Plus particulièrement dans une équipe du département « Nutrition-Santé et Filières Agricoles » (NSFA) dirigé par Hervé Jacob. Ce département regroupe plusieurs équipes d’enseignants-chercheurs qui travaillent sur des thèmes très variés : les probiotiques utilisables en santé humaine comme en agriculture (élevage comme cultures végétales !), la nutrition humaine, la qualité de la viande et le bien-être animal au sens large (juste avant qu’il ne passe à la casserole, entendons nous bien…). Malheureusement, même s’il y a un espace consacré sur le site de l’école, le département NSFA n’a pas de site internet digne de ce nom qui permette d’englober d’un seul regard l’ensemble des activités de recherche. C’est bien dommage.

J’ai intégré la petite équipe dirigée par Michel Le Hénaff, maître de conférence spécialisé dans la microbiologie, et composée alors de Sandrine Papillon, ingénieur d’études spécialisée en chimie, et d’Alexandra Grasteau qui était doctorante (thèse soutenue en décembre 2015). Ma mission était alors d’intégrer un projet sur la lutte contre la flavobactériose.

Le problème de la flavobactériose dans les élevages de truites (et autres salmonidés)

gram-FP-JIP — *Flavobacterium psychrophilum* au microscope photonique (coloration Gram)

Qu’est-ce que la flavobactériose ? C’est le nom générique d’une maladie bactérienne qui touche certains poissons, d’élevage ou sauvages. Le terme manque d’ailleurs de précision puisqu’il y a plusieurs espèces de flavobactéries qui touchent des gammes différentes de poissons sous la poussée de stress et conditions environnementales différentes. Je ne me suis occupé que d’une seule de ces espèces : Flavobacterium psychrophilum. « Flavo » signifie « jaune » (parce que ces bactéries synthétisent un pigment jaune, la riboflavine, facilement repérable quand on les met en culture) ; « psychro » signifie « froid » et « philum » signifie « qui aime ». La bactérie jaune qui aime le froid. Cette bactérie découverte au milieu du XXe siècle s’avère être à l’origine de deux maladies affectant principalement les salmonidés (saumons, truites, ombles, etc.) :

BCWD causant une ulcération sur le flan d'un ayu (Plecoglossus altivelis) — BCWD causant une ulcération sur le flan d’un ayu (*Plecoglossus altivelis*)

la première est la maladie des eaux froides (Bacterial Cold Water Disease, BCWD) qui affecte les poissons adultes et induit l’apparition d’ulcérations cutanées qui sont mortelles ou du moins rendent le poisson invendable. Cette maladie a commencé à poser problème en Amérique du Nord dans les années 1980, chez les salmonidés sauvages dont la progéniture (les œufs) était récupérée pour être exploitée dans la filière de l’alimentation ou pour le repeuplement de cours d’eau. Du fait de l’essor de la pisciculture et de la mondialisation (qui a entrainé l’exportation d’œufs et de poissons de l’autre côté de l’Atlantique et du Pacifique) la bactérie s’est invitée sur le Vieux Continent et dans ces pays asiatiques au climat tempéré où ces poissons sont consommés. Là, en Europe, une nouvelle forme de flavobactériose s’est exprimée dans les élevages de truites arc-en-ciel (et de truites fario) : le syndrome de l’alevin de la truite arc-en-ciel (Rainbow Trout Fry Syndrome, RTFS). Comme son nom l’indique cette maladie touche plutôt les jeunes poissons, les alevins. La maladie infecte de manière systémique ce jeune poisson dont les défenses immunitaires sont trop faibles pour être efficaces ; malade, celui-ci arrête de s’alimenter et meurt. Si le problème n’est pas pris à bras le corps par le pisciculteur, les pertes peuvent être importantes (on parle de cas où 90 % du banc de poissons est affecté).

Que ce soit la BCWD ou le RTFS, une seule espèce bactérienne responsable : Flavobacterium psychrophilum. Cette dernière est une espèce que l’on retrouve dans les cours d’eau avec d’autres espèces du même genre. Opportuniste, il semble qu’elle ne devienne problématique que lorsque des facteurs de stress se mettent en place chez le poisson : stress de manipulation, blessures, densité d’élevage trop importante, qualité d’eau de bassin médiocre ou variations de température, etc. Comme son nom l’indique, les crises de flavobactériose ont plutôt lieu quand les températures sont basses (avec un optimum autour de 15 °C).

Le soin consistant à donner un antibiotique mélangé à l’alimentation (le florfénicol, analogue du chloramphénicol plus connu des biologistes moléculaires), il est difficile pour les pisciculteurs de soigner les poissons malades puisque ces derniers ne s’alimentent plus. L’alimentation supplémentée ne sert alors qu’à protéger le reste du banc contre une infection provenant des poissons voisins ou des eaux de bassin. Cette solution n’est pas la panacée : tout d’abord elle est chère pour des animaux qui ne le sont pas mais surtout, l’usage des antibiotiques est controversé. Ces derniers doivent être utilisés le moins possible pour nos animaux comme pour nos rhumes, une sur-utilisation entrainera l’apparition de souches bactériennes antibiorésistantes et ce sera d’autant plus gênant que F. psychrophilum n’est sensible qu’au seul florfénicol. C’est le dernier carton de munitions, il vaut mieux ajuster le tir comme un sniper que faire un tir de barrage à la sulfateuse…

Le talent des pisciculteurs pour sauver leurs exploitations de ce fléau est de combiner tout un arsenal de mesures de prévention : mesures d’hygiène, nettoyages de bassins, désinfection des eaux en amont, traitements biocides prophylactiques réguliers. Les consommateurs n’ont pas idée du trésor de technicité qu’il faut développer pour obtenir cette truite-portion ou ce filet de saumon fumé qu’ils prennent nonchalamment à leur rayon poissonnerie préféré.

Alevins de truite arc-en-ciel (*Oncorhynchus mykiss*)

Mais la partie n’est pas encore gagnée, loin de là : la maladie progresse malgré les mesures de prévention déployées. Celle-ci n’est pas encore suffisamment connue : quels sont les réservoirs (c’est-à-dire les espèces ou compartiments écologiques où la bactérie demeure avant d’infecter les poissons) ? Quelle est la dynamique d’infection (cette question en sous-entendant deux autres que sont : quels sont les moyens de défense des poissons et comment sont-ils contournés ?) Quels moyens de prévention spécifique peut-on déployer (vaccins ? traitements biocides optimisés ?) Y a-t-il une marge d’optimisation pour les moyens de prévention non-spécifiques à F. psychrophilum ? Ou pour les pratiques d’élevage, l’utilisation de produits prébiotiques ou probiotiques ? Ajoutons à ça qu’il y a besoin d’outils de détection, de quantification de la bactérie, que ce soit pour la recherche et le développement des stratégies de prévention ou tout simplement assurer une traçabilité de leur efficience une fois qu’elles sont mises en place sur le terrain. Il y a déjà plein de méthodes de suivi de la flavobactériose mais il y a toujours une marge d’optimisation et/ou l’émergence de besoins spécifiques auxquels les outils existants ne permettent pas toujours de répondre.

C’est donc pour répondre à certaines de ces questions qu’un projet de recherche a été concocté. En partie financé par des fonds européens (le Fonds Européen de DEveloppement Régional, FEDER), la Région Aquitaine et le Comité Interprofessionnel des Produits de l’Aquaculture (CIPA), il a impliqué l’équipe de Michel Le Hénaff, le laboratoire départemental des Pyrénées et des Landes (LDPL, plus connu jadis comme le Laboratoire Départementale des Landes, LD40) représenté par Patrick Daniel et le Groupement de Défense Sanitaire Aquacole d’Aquitaine (GDSAA, pas de site internet… seriously ? Même pas un compte Twitter pour communiquer ?) représenté par Valérie Chesneau. Et bien entendu, un panel de pisciculteurs de la région Aquitaine-Limousin-Poitou-Charentes.

Réduire la transmission verticale de la Flavobactériose par l’optimisation des techniques de désinfection des œufs

C’est ce volet du projet « Flavo » que je vais aborder particulièrement dans ce billet déjà bien entamé. Il y en a eu d’autres mais celui-ci a fait l’objet d’une publication dans la revue Journal of Aquaculture Research and Development :

« Evaluation of Glutaraldehyde, Chloramine-T, Bronopol, Incimaxx Aquatic® and Hydrogen Peroxide as Biocides against Flavobacterium psychrophilum for Sanitization of Rainbow Trout Eyed Eggs » Auteurs : Alexandra Grasteau, Thomas Guiraud, Patrick Daniel, Ségolène Calvez, Valérie Chesneau et Michel Le Hénaff. Le PDF peut être téléchargé là.

Comme le veut l’usage, cet article est donc rédigé en anglais avec tous les détails techniques nécessaires pour reproduire les expériences en question et pour convaincre les lecteurs des conclusions que nous proposons. Rappelez vous que mon but ici n’est pas de vous en restituer le détail et encore moins de vous le traduire. Les spécialistes du domaine iront directement lire l’article et y trouveront tout ce dont ils ont besoin. Moi, ici, je veux vous en tirer les grandes lignes, souligner ce que je pense être les apports de notre travail et d’éventuelles perspectives. Je voudrais aussi préciser que je ne me fais en aucun cas le porte-parole de mes co-auteurs ni des institutions pré-citées. Considérez tout ceci comme une discussion autour d’un verre ou d’un café lors de laquelle vous me demanderiez ce sur quoi j’ai travaillé ces dernières années ou, en l’occurrence, sur quoi porte ma dernière publication.

Structure d'une population de F. psychrophilum d'origine chilienne déterminée par MLST (Multi-Locus Sequence Typing). La taille des points noirs correspond au nombre d'isolats du même type, les traits reliant ces points représentent la parenté directe entre ces types d'isolats et les zones grisées regroupent les isolats de F. psychrophilum directement ou indirectement apparentés et démontrent le caractère épidémique du RTFS/BCWD. Ce type de structure a été démontré pour d'autres populations de F. psychrophilum dans le monde. Image tirée de l'article Avendaño-Herrera et al., Veterinary Microbiology, 2014 — Structure d’une population de *F. psychrophilum* d’origine chilienne déterminée par MLST (Multi-Locus Sequence Typing). La taille des points noirs correspond au nombre d’isolats du même type, les traits reliant ces points représentent la parenté directe entre ces types d’isolats et les zones grisées regroupent les isolats de *F. psychrophilum* directement ou indirectement apparentés et démontrent le caractère épidémique du RTFS/BCWD. Ce type de structure a été démontré pour d’autres populations de *F. psychrophilum* dans le monde.
Image tirée de l’article de Avendaño-Herrera et al., Veterinary Microbiology, 2014

Revenons à la flavobactériose. Cette maladie est transmise de deux manières : la transmission horizontale c’est-à-dire par contact d’un individu à un autre, directement ou en contaminant l’environnement notamment l’eau de bassin, les sédiments, etc. (par analogie avec les humains, ce peut être une bise, un éternuement, une poignée de porte contaminée, etc.) et la transmission verticale c’est-à-dire la transmission d’un géniteur à sa progéniture (par comparaison, chez l’homme, ça correspondrait à la transmission du HIV de la mère à l’enfant). La propagation internationale de cette maladie a pu se réaliser à cause de la capacité de F. psychrophilum à se transmettre de manière verticale : Prélevés sur un lieu A, les œufs d’un géniteur infecté ont été utilisés pour l’élevage qui s’est réalisé en un lieu B, contaminant les autres poissons présents qui ont eux même donné une descendance infectée transférée à un lieu C, etc. La mobilité des poissons (naturelle ou via l’activité humaine) et l’alternance de la transmission verticale et horizontale ont permis la propagation de la maladie dans l’ensemble des pays producteurs de salmonidés. L’étude de l’évolution de certains gènes de Flavobacterium psychrophilum (par une stratégie de Multi Locus Sequence Typing, MLST, parfois combinée à celle de Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE, qui sont deux techniques qui permettent de déterminer une sorte de code-barre génétique pour chaque individu étudié et par conséquent d’avoir un aperçu de la structure génétique d’une population. Les souches évolutivement proches partageant tout ou partie de leur profil génétique tel qu’il est déterminé par MLST ou par PFGE. Je développe à la demande dans les commentaires !) semble démontrer que F. psychrophilum s’est répandue de cette manière, de proche en proche, de géniteur à la progéniture, se partageant une souche qui évolue petit à petit. D’autres études sur la transmission verticale (du géniteur à l’œuf) montrent la réalité de cette hypothèse : la femelle adulte est porteuse saine (ses défenses immunitaires lui permettent d’y survivre) et les bactéries présentes dans sa cavité abdominale sont transmises aux ovules pendant la longue phase qui précède la ponte. Les bactéries survivent jusqu’à l’éclosion et infectent la jeune larve (le petit poisson obtenu après éclosion est appelé larve. Plus tard la larve deviendra alevin puis truitelle et truite adulte), l’épidémie se déclenchant ensuite localement lorsque les conditions deviennent favorables.

La flavobactériose n’étant pas la seule maladie transmise par les œufs, les pisciculteurs tentent déjà de prévenir la transmission verticale de diverses maladies, ceci par le biais d’étapes de désinfection des œufs et d’élimination manuelle des œufs affectés (qui peuvent par exemple changer de couleur quand ils meurent). Or ces mesures de prévention ne sont pas toutes adaptées à la flavobactériose. Tout d’abord, la présence de F. psychrophilum dans les œufs ne leur est pas nuisible : ils survivent et ne présentent pas de symptôme particulier qui permette de les repérer et les éliminer manuellement. Ensuite, les traitements désinfectants utilisés de nos jours ont pour la plupart été développés pour prévenir d’autres maladies (bactériennes, fongiques, virales ?). Celui qui est le plus utilisé est basé sur les propriétés désinfectantes de la povidone iodée ou des molécules analogues. Vous connaissez sûrement cette molécule puisque ce n’est rien d’autre que de la bétadine qui est en quelque sorte un grosse molécule polymère sur laquelle sont liées des molécules d’iode qui portent le pouvoir désinfectant et qui sont relarguées petit à petit dans le milieu ; sans ce système, le pouvoir désinfectant de l’iode serait trop fugace et instable. Malheureusement, les traitements actuels (en terme de concentration et en terme de temps de contact) ne sont pas suffisamment agressifs pour affecter durablement Flavobacterium psychrophilum et prévenir sa transmission à la progéniture salmonidée.

Durant nos travaux, nous avons porté notre attention sur d’autres molécules désinfectantes, une douzaine parmi les produits potentiellement utilisables par les pisciculteurs. Parmi eux, les plus marquants sont le florfénicol (l’antibiotique utilisé pour soigner les poissons) ou encore le chlorure de sodium (le sel de table, toxique pour F. psychrophilum… et pour la truite) mais surtout cinq molécules candidates comme le bronopol, le glutaraldéhyde, le peroxyde d’hydrogène, l’acide peracétique et la chloramine. Le choix s’est finalement porté sur ces molécules parce que leurs propriétés anti-flavobactériennes étaient mal cernées et/ou parce qu’elles étaient prometteuses (le peroxyde d’hydrogène et l’acide peracétique sont inoffensifs pour l’environnement, le glutaraldéhyde qui lui est potentiellement très toxique pour la bactérie).

Une des méthodes couramment utilisées pour déterminer le pouvoir désinfectant d’une molécule est la détermination de sa Concentration Minimale d’Inhibition (CMI) : ça consiste à ajouter une molécule candidate en concentration croissante dans une solution bactérienne et observer sa croissance. Si la culture bactérienne continue à croitre à telle concentration de désinfectant, c’est qu’elle n’est pas suffisamment concentrée ; si la culture bactérienne ne croit plus, la concentration de désinfectant est suffisante. La concentration de désinfectant la plus basse ayant le pouvoir de bloquer la croissance bactérienne détermine la CMI. Joli sur le papier mais cette méthode implique un temps de contact long, plusieurs jours, qui ne correspond pas à la réalité des traitements désinfectants opérés par les pisciculteurs (quelques minutes à une heure, les œufs ayant besoin d’un apport d’oxygène (O₂), ils ne peuvent pas rester trop longtemps sans renouvellement de l’eau sans s’asphyxier). Certes, si un désinfectant est suffisamment concentré pour inhiber la croissance bactérienne sur plusieurs jours, on se doute que la population bactérienne est bel et bien détruite avant que la molécule désinfectante ne soit naturellement dégradée. Mais du fait de l’absence d’information concernant la rémanence du désinfectant et le temps de contact nécessaire pour détruire la population bactérienne, nous avons préféré proposer une autre méthode pour estimer le pouvoir anti-flavobactérien de notre panel de produits désinfectants.

Pour déterminer ce pouvoir bactéricide, nous avons utilisé une méthode basée sur les barèmes de stérilisation en génie industriel : on expose une population de F. psychrophilum à un désinfectant à une concentration donnée et on suit l’évolution de cette population au cours d’un temps limité et connu (jusqu’à 40 min en ce qui nous concerne, la fourchette haute des durées de désinfection que s’autorisent les pisciculteurs). Cette expérience nous donne pour chaque concentration le temps nécessaire pour décimer la population (réduire une population au 1/10ème de ce qu’elle était initialement), on appelle ça le temps de réduction décimale. Ceci nous permet de proposer un jeu de correspondances entre durée de traitement et concentration de désinfectant pour obtenir le même degré de destruction. On pourrait naturellement arguer que la décimation d’une population bactérienne est loin d’être une désinfection totale mais les chiffres que nous avons obtenus semblent indiquer que les intensités de traitements utilisées jusqu’alors en pisciculture étaient en deçà de ce qui est nécessaire pour ne serait-ce que décimer les populations de F. psychrophilum. Avant de déterminer les intensités de traitement nécessaires pour réduire une population de F. psychrophilum d’un facteur 100 ou 1000, il nous a paru plus pertinent de tester les différentes intensités de traitements sur la viabilité des œufs de truite.

Pour cela, nous avons fait une expérience très simple : pour chacun des désinfectants d’intérêt, nous nous sommes calés sur une durée de traitement de 20 minutes correspondant à ce qui est pratiqué sur le terrain et avons choisi trois concentrations différentes : une suboptimale proche de celle utilisée actuellement dans la filière, une concentration qui correspond aux intensités de traitement que nous avons précédemment déterminées et une concentration exagérément haute que nous pensions délétère pour les œufs de truite. Après traitement, nous avons laissé les œufs se développer et, après éclosion, attendu que les larves deviennent alevins et commencent à se nourrir. Le but du jeu étant de pouvoir observer d’éventuelles malformations.

Le résultat, c’est que les œufs de truite sont incroyablement résistants : ils ont bien entendu survécu aux traitements les plus faibles (déjà connus pour leur innocuité envers les œufs puisque utilisés dans la profession), aux nouvelles conditions de traitements mais aussi aux intensités de traitement les plus violentes. A un désinfectant près puisque les plus traitements les plus forts réalisés avec le glutaraldéhyde avaient quand même un impact négatif ; résultat à pondérer puisque je suspecte que l’efficacité du rinçage post-désinfection améliore la survie des œufs. S’il fallait perdre 10 % des œufs grâce à un traitement violent mais ponctuel pour réduire les traitements prophylactiques subséquents et la survenue de crises de flavobactériose, le jeu pourrait en valoir la chandelle, non ? Mais ça reste encore à prouver, ce n’est qu’une opinion personnelle. Toujours est-il que les autres désinfectants même très concentrés n’affectent pas la survie des œufs et n’entrainent ni malformation ni variation de poids (ce qui n’est pas indiqué dans l’article mais qui a quand été vérifié). Ce qui en soit est intéressant pour la profession qui sait maintenant qu’elle bénéficie d’une plus grande marge de manœuvre (technique à défaut d’être administrative…) pour ces traitements de désinfection avec notamment des substances inoffensives pour l’environnement comme le peroxyde d’hydrogène ou l’acide peracétique.

Les réalisations moins évidentes de ces travaux mais non moins intéressantes

Si les résultats principaux sont la mise au point de traitements anti-flavobactériens plus efficaces et inoffensifs pour les œufs et alevins subséquents, je voudrais maintenant mettre en avant trois points de ces recherches que je trouve intéressants.

Le plus trivial c’est la réalisation de paniers d’incubation compartimentés. Ils n’ont pas été achetés quelque part mais bel et bien imaginés et réalisés par Michel Le Hénaff et Alain Rives de Bordeaux Sciences Agro. Basés sur les dimensions d’un modèle utilisé en pisciculture, ils assurent un débit optimal et peuvent contenir 200 œufs/larves dans chaque compartiment sachant que chaque panier d’incubation en contient six. Ce dispositif très pratique nous a permis de tester un nombre optimal de répétitions sur un espace réduit et surtout dans des conditions similaires : on a obtenu une meilleure reproductibilité sur une expérimentation en ferme aquacole sans occuper un espace excessif dans cette dite ferme. Ce qui n’est pas un vain mot quand on considère que les fermes piscicoles participantes l’ont fait bénévolement et sur la base du volontariat. Ce serait dommage qu’un tel dispositif ne profite pas au plus grand nombre sur d’autres types d’expérimentations.
L’autre réalisation, c’est le test de viabilité par EMA-qPCR que nous avons mis au point pour suivre la survie de Flavobacterium psychrophilum exposée aux divers traitements biocides. Nous n’avons pas inventé la technique, loin de là, elle date au moins de 2006, mais la mise au point était ardue et je suis d’autant mieux placé pour en parler que c’est moi qui l’ai réalisée ainsi que les tests qui ont suivi. Cette technique fait appel au monoazide d’éthidium (EMA). Cette molécule est ce qu’on appelle un intercalant qui se fixe à l’ADN. Activé par une forte intensité lumineuse, il se fixe définitivement à l’ADN qu’il clive au passage. Si on combine cette propriété au fait que cette molécule ne pénètre pas dans les cellules saines, on peut l’utiliser pour distinguer les cellules mortes des cellules vivantes : si la cellule est vivante, l’EMA ne rentre pas dans la cellule, ne se fixe à rien et sa photo-activation n’a aucun impact, l’ADN de la cellule vivante demeure détectable une fois qu’on l’a extrait. Si la cellule est morte ou mourante, l’EMA rentre dans la cellule, se fixe à l’ADN et la photo-activation entraine la dégradation de l’ADN qu’on ne peut plus détecter par la suite. Nous avons utilisé les techniques bien connues de PCR qui permettent de détecter spécifiquement et de quantifier l’ADN de F. psychrophilum. On nous a reproché de ne pas avoir utilisé une méthode de quantification classique qui consiste à mettre les bactéries en culture et de les compter. D’autant plus que la technique sophistiquée que nous avons utilisée est plus chère. C’est un débat vieux de quinze ans désormais, les techniques d’énumération sont robustes et peu chères et, même si je suis biologiste moléculaire et plutôt enclin à utiliser des techniques toujours plus innovantes, je suis très sensible à ce genre d’argument. Mais concrètement, une fois la mise au point réalisée, cette technique d’EMA-qPCR permet de manipuler simultanément un grand nombre de petits échantillons dans les mêmes conditions et d’avoir les résultats pour un désinfectant dans la journée voire en une grosse demi-journée si on est rôdé. On peut potentiellement adapter le protocole pour quantifier la viabilité dans des cultures un peu particulières comme les biofilms dans lesquels la proportion de bactéries cultivables/non-cultivables n’est pas forcément idéale pour les techniques classiques d’énumération. Cette technique me semble prometteuse, le seul point noir est le besoin de mise au point spécifique à chaque espèce bactérienne testée. Mise au point déjà réalisée pour F. psychrophilum…
Le dernier point intéressant de ces travaux outre les apports pour la filière piscicole, c’est l’utilisation de ces fameux barèmes de stérilisation, la détermination de ces temps de réduction décimale. C’est utilisé dans le milieu industriel pour la mise au point de méthodes de stérilisation par la chaleur par exemple. Ou pour l’enzymologie, la préservation des qualités nutritionnelles de produits alimentaires pendant leur transformation. Quelque chose de finalement assez exotique dans le milieu de l’ichtyopathologie : un article de revue est récemment sorti sur les diverses techniques et marges d’optimisation des techniques de désinfection des œufs et il n’en ressort pas que cette méthode d’objectivation des propriétés désinfectantes d’un produit soit particulièrement utilisée ni même connue. Au delà de ce jeu de correspondances Durée de traitement/Concentration de biocide utilisable pour les pisciculteurs, ce système nous donne accès à une autre valeur plutôt abstraite de prime abord mais non dénuée d’intérêt : la valeur Z aussi appelée paramètre de thermorésistance caractéristique d’un micro-organisme. Dans notre cas, on pourrait appeler cette valeur le paramètre de chimiorésistance caractéristique d’un micro-organisme (ou on pourrait continuer à l’appeler valeur Z, hein ?). Concrètement, cette valeur correspond à l’augmentation de concentration nécessaire pour réduire la durée d’exposition de 90 % ou pour être 10 fois plus efficace dans le pouvoir désinfectant. Exemple fictif, si on a une valeur Z de 100 g/L pour de la poudre de perlimpinpin qui détruit 90 % d’une suspension de levure en 40 min en l’utilisant à 200 g/L, ça veut dire que si on augmente cette concentration de 100 g/L (la valeur Z) en passant à 300 g/L, on détruit 90 % des levures en 4 min au lieu de 40 min ou on détruit 99 % des levures en 40 min au lieu de 90 %. A l’inverse, si on réduit la concentration de la poudre de perlimpinpin à 100 g/L, on sait qu’il va falloir 400 min (~7 h) pour éliminer 90 % des levures ou qu’en 40 min, on n’en aura éliminé que 9 %. Ce paramètre Z étant spécifique d’un biocide et d’un micro-organisme, il peut aussi être exploité de deux manières : pour un micro-organisme donné, il permet de comparer le pouvoir désinfectant de différentes molécules. Ainsi, dans l’article, on montre que l’Incimaxx (l’acide peracétique) est beaucoup plus agressif que le peroxyde d’hydrogène alors qu’ils fonctionnent tous les deux de la même manière sur la bactérie. Le corolaire, c’est que ça veut aussi dire que si on se plante un peu dans la confection de la solution de peroxyde d’hydrogène, ça aura moins d’impact qu’en manipulant de l’Incimaxx. L’autre utilisation de cette donnée, c’est plutôt pour la recherche : pour une molécule désinfectante donnée, on peut comparer la chimiorésistance de différents micro-organismes voire même plusieurs souches de la même espèce (par exemple une souche de F. psychrophilum isolée sur du saumon royal, une souche isolée sur de l’ayu, une autre sur de la truite arc-en-ciel, etc). Ça nous permettrait de phénotyper ces souches, c’est-à-dire décrire les caractéristiques spécifiques d’une souche. Comme pour le typage génétique (le génotypage) dont j’ai parlé plus haut (MLST/PFGE), ce genre d’informations sert à mieux comprendre l’évolution d’un organisme et son adaptation à son environnement et son hôte. Mieux comprendre le pathogène pour mieux lutter contre lui. Et tout ça, ces « barèmes de stérilisation », ça peut être utile pour d’autres maladies que la flavobactériose des poissons mais peut aussi être utilisé pour la santé humaine, l’agro-alimentaire, l’œnologie, les herbicides, etc. Voire toute étude visant à caractériser l’impact d’un facteur/traitement sur une population (ex: impact de l’installation d’un logiciel sur un parc informatique sur la prévalence de virus/spywares, comparaison de l’impact de campagnes de prévention sur la prévalence de fumeurs ou d’accidents de la route, etc.). On sort de mon domaine d’expertise, je suppose que des méthodes d’objectivation du même genre sont utilisées d’une manière ou d’une autre…

Concluons sur ce billet qui commence à être plus long que l’article originel. J’espère que j’ai atteint les objectifs principaux que je me suis fixé : raconter mon boulot à mon entourage plus ou moins proches (famille, amis, anciens collègues ou contacts divers) d’une manière suffisamment précise mais accessible au risque de produire un texte assez touffu mais sur lequel on peut revenir à loisir, visibiliser nos recherches (c’est-à-dire à la fois expliciter le contenu de mon CV et exposer les travaux de cette équipe de Bordeaux Sciences Agro) et porter un éclairage peut-être nouveau sur certains aspects de la pisciculture, ce à quoi les éleveurs peuvent être confrontés et comment la recherche peut répondre à certains de leurs besoins. Je voudrais préciser que ces travaux sont bel et bien de la recherche appliquée, ce sont des expériences préliminaires et non pas des pratiques industrielles du genre inonder les cours d’eau de France et de Navarre avec des hectolitres de glutaraldéhyde… Je précise une fois de plus que cet article n’est pas un publireportage de la filière aquacole ni même de Bordeaux Sciences Agro, c’est juste moi, Thomas Guiraud, qui devise sur des travaux de recherche déjà publiés.

A l’avenir, je souhaiterais faire le même type d’article sur mes précédents travaux (de thèse, de post-doc) avec une limitation, c’est que je ne peux pas aborder avec précision les travaux non publiés (et il y en a pas mal de 2005 à 2012). Je verrais le moment venu. Concernant la flavobactériose, le projet en question était plus large, il y a eu d’autres résultats qui sont en cours de valorisation ou qui ont servi à d’autres projets en cours. J’en parlerai sur le blog mais je ne peux pas aller plus vite que la musique…

PS : les images viendront petit à petit pour égayer ce pavé :3

Optimizing the disinfection of trout eggs to contain flavobacteriosis

I would like to introduce today a serie of articles which will explain my work in biology and make it intelligible to curious visitors without necessarily being specialists. For this first post, I will talk about the work we published in December 2015 on flavobacteriosis. Before I talk about it, I start with the context of work.

Switching from plant biology to ichthyopathology

Since 2012, I had the opportunity to change my research topic and move from plant biotechnology and improving the qualities of the fruit to animal microbiology, ichthyopathology (or study of fish diseases). This conversion seemed quite surprising for those who know me : I quickly specialized in plant biology during my initial training and had always worked on lettuce, tobacco but ultimately on tomatoes.

These topics seem apparently diametrically opposed but not so much : yes, I’m a « vegetalist » but above all I’m a molecular biologist and molecular biology is practiced in much the same way if one works on tomato, viruses, bacteria, human or pangolin. I would even say that it is a bit more complicated to work on plants and that extracting rainbow trout nucleic acids when you used to extract RNA from strawberry leaves is as difficult as reconverting yourself as a security agent in a nightclub of a quiet town in Massachusetts after having waged war in Vietnam : there is a tendency to bring out your heavy artillery at the slightest glitch whereas, finally, it is enough to just show up to be effective.

Welcome to the « Feed and Food » department of Bordeaux Sciences Agro

So I was greeted at Gradignan, near Bordeaux, in a laboratory in Bordeaux Sciences Agro, the Higher National School of Agricultural Sciences of Bordeaux Aquitaine, formerly ENITA, just the school of agricultural engineers in the region. Especially in a team of the Department « Feed and Food » directed by Hervé Jacob. This department brings together several teams of professors and researchers working on a wide range of topics : probiotics that can be used in human health as well as in agriculture (from breeding to vegetable crops !), Human nutrition, meat quality and animal welfare in the broad sense (just before it passes to the pan…). Unfortunately, even if there is a dedicated space on the school’s website, the Feed and Food department does not have a proper website that allows to include at a glance all the research activities. It’s too bad.

I joined the small team led by Michel Le Hénaff , assistant professor specializing in microbiology, and then composed of Sandrine Papillon , engineer specializing in chemistry, and Alexandra Grasteau who was a doctoral student (defense in December 2015 ). My mission was then to integrate a research project about flavobacteriosis.

The problem of flavobacteriosis in trout (and other salmonid)

What is flavobacteriosis ? This is the generic name of a bacterial disease that affects some fish, either farmed or wild. The term also lacks precision since there are several species of flavobacteria that affect different ranges of fish under stress and different environmental conditions. I’ve taken care of only one of these species : Flavobacterium psychrophilum. « Flavo » means « yellow » (because these bacteria synthesize a yellow pigment, riboflavin, readily detectable when cultured); « Psychro » means « cold » and « philum » means « who loves ». The yellow bacterium that likes the cold. This bacterium discovered in the middle of the twentieth century proves to be the cause of two diseases affecting mainly salmonids (salmon, trout, char, etc.) :

BCWD causing ulceration caused on the side of an ayu (Plecoglossus altivelis) — BCWD causing ulceration caused on the side of an ayu (*Plecoglossus altivelis*)

The first is the Bacterial Cold Water Disease (BCWD), which affects adult fish and induces the appearance of cutaneous ulcerations that are fatal or, at least, make the fish unsaleable. This disease began to be a problem in North America in the 1980s, in wild salmonids whose offspring (eggs) were recovered for use in the food chain or for the restocking of streams. Given the rise of fish farming and globalization (which has led to the export of eggs and fishes across the Atlantic and the Pacific), the bacterium has been invited to the Old Continent and in temperate climate countries in Asia where these fish are consumed. There, in Europe, a new form of flavobacteriosis was expressed in rainbow trout (and fario trout) : rainbow trout fry syndrome (RTFS). As the name indicates, this disease affects young fish, fry. The disease infects this young fish whose immune defenses are too weak to be effective; sick, he stops feeding and dies. If the problem is not handled by the fish farmer, the losses can be significant (cases where 90% of the fish bank is affected).

Whether BCWD or RTFS, a single bacterial species is responsible : Flavobacterium psychrophilum. The latter is a species found in rivers with other species of the same genus. Opportunistic, it seems that it becomes problematic only when stress factors occur in fish : handling stress, injuries, excessive stocking density, poor pond water quality or temperature variations, etc. As the name suggests, flavobacterial seizures tend to occur when temperatures are low (with an optimum around 15 ° C).

The care of giving an antibiotic mixed with the diet (florfenicol, an analogue of chloramphenicol well known to molecular biologists), makes it difficult for fish farmers to treat diseased fish, as the latter no longer feed. The supplemental feeding then serves only to protect the rest of the fish bank against infection from neighboring fish or pond water. This solution is not the panacea : first of all it is expensive for animals that are not, but above all, the use of antibiotics is controversial. These should be used as little as possible for our animals (and for us) overuse will lead to the emergence of antibiotic resistant bacterial strains and it will be more embarrassing as F. psychrophilum is sensitive only for florfenicol.

The talent of fish farmers to save their fishes from this scourge is to combine a whole arsenal of prevention measures : hygiene measures, cleaning of ponds, disinfection of upstream waters, regular biocidal prophylactic treatments. Consumers have no idea of the treasure of technicality that must be developed to get this trout-portion or that smoked salmon fillet.

Rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) — Rainbow trout fry (*Oncorhynchus mykiss*)

But the fight is not yet won, far from it : the disease progresses despite the measures of prevention deployed. This is not yet sufficiently known : what are the reservoirs (ie species or ecological compartments where the bacterium remains before infecting the fish) ? What is the dynamics of infection (this question implies two other ones : what are the defenses of the fish and how are they circumvented ?) What specific means of prevention can be deployed (vaccines, optimized biocidal treatments ?) is it still possible to optimize means of prevention non-specific to F. psychrophilum ? Is it possible to use prebiotic or probiotic products ? Moreover there is a need for tools to detect and quantify the bacteria, whether for the research and development of prevention strategies or simply to ensure traceability of their efficacy once they are set in fish farms. There are already many methods for monitoring flavobacteriosis, but there is always scope for optimization and/or the emergence of specific needs that the existing tools do not always allow to answer.

It is therefore to answer some of these questions that a research project has been concocted. Partly financed by European funds, the Aquitaine Region and the Interprofessional Committee for Aquaculture Products (CIPA), it involved the team of Michel Le Hénaff, the county laboratory of Pyrenees and Landes (LDPL, known formerly as the county laboratory of Landes, LD40) represented by Patrick Daniel and the aquaculture health defense group from Aquitaine (GDSAA) represented by Valérie Chesneau. And, of course, a panel of fish farmers from the Nouvelle Aquitaine region.

Reduce the vertical transmission of Flavobacteriosis by optimizing egg disinfection techniques

It’s this aspect of the « Flavo » project that I will address particularly in this note already well begun. There have been other aspects in this project, but this one has been published in the Journal of Aquaculture Research and Development :

« Evaluation of Glutaraldehyde, Chloramine-T, Bronopol, Incimaxx Aquatic® and Hydrogen Peroxide as Biocides contre Flavobacterium psychrophilum for Sanitization of Rainbow Trout Eyed Eggs » Authors : Alexandra Grasteau Thomas Guiraud, Patrick Daniel, Segolene Calvez, Valerie and Michel Chesneau Hénaff. The PDF can be downloaded here.

As usual, this article is written in English with all the technical details necessary to reproduce the experiments and to convince the readers of the conclusions we propose. Remember that my goal here is not to give you the details. Specialists will go directly to the paper and find everything they need. Here, I want to draw the broad outlines, highlight what I think are the contributions of our work and possible prospects. I would also like to point out that I am not in any way the spokesman for my co-authors or for the institutions mentioned above. Consider all this as a discussion around a drink or a coffee in which you would ask me what I have been working on in recent years or, in this case, what my latest publication is about.

Let’s go back to flavobacteriosis. This disease is transmitted in two ways : horizontal transmission, that is, by contact between one individual and another, directly or by contaminating the environment, especially pond water, sediments, and so on… (by analogy with humans, it may be a kiss, a sneeze, a contaminated door handle, etc.) and vertical transmission, i.e. the transmission of a genitor to its offspring (the equivalent for human would correspond to the transmission of HIV from mother to child). The international spread of the disease was made possible because of the ability of F. psychrophilum to be transmitted vertically : taken from a location A, the eggs of an infected progenitor were used for breeding which is process in a location B, contaminating other fishes which themselves have given an infected offspring transferred to a location C, etc. The movement of fish (natural or via human activity) and the alternation of vertical and horizontal transmission have allowed the spread of the disease in all the countries who produce salmonids. The study of the evolution of certain genes of Flavobacterium psychrophilum seems to demonstrate that F. psychrophilum spread in this way, step by step, from parent to offspring, sharing strains that evolved continuously. Other studies of vertical transmission show the reality of this hypothesis : the adult female is a healthy carrier (its immune defenses allow it to survive) and the bacteria present in its abdominal cavity are transmitted to the eggs during the long phase preceding laying. The bacteria survive until hatching and infect the young larva (the small fish obtained after hatching is called larva, later the larva will become fry then adult trout), the epidemic then triggering locally when the conditions become favorable.

Since flavobacteriosis is not the only disease transmitted by eggs, fish farmers are already attempting to prevent the vertical transmission of various diseases through egg disinfection and the manual elimination of affected eggs (which can change color when they die). These prevention measures are not all adapted to flavobacteriosis. Firstly, the presence of F. psychrophilum in eggs does not harm them, they survive and show no particular symptom that could allow the fish farmer to identify and remove them manually. Then, the disinfectant treatments used today have mostly been developed to prevent other diseases (bacterial, fungal, viral ?). The most common treatment is based on the disinfecting properties of povidone iodine (or other similar iodophores). You probably know this molecule since it is nothing but Betadine, which is a kind of polymer molecule on which are bound iodine molecules that carry the disinfectant power and which are released little by little into the middle ; without this system, the disinfectant power of iodine would be too fleeting and unstable. Unfortunately, current treatments (in terms of concentration and in terms of contact time) are not aggressive enough to affect lasting Flavobacterium psychrophilum and prevent its transmission to the offspring.

During our work, we focused our attention on other disinfectant molecules, a dozen of the products potentially usable by fish farmers. Among them, the most notable are florfenicol (antibiotic used to treat fish) or sodium chloride (table salt is toxic for F. psychrophilum… and trout) but especially five candidate molecules as bronopol , glutaraldehyde, hydrogen peroxide, peracetic acid and chloramine. These molecules were ultimately chosen because their anti-flavobacterial properties were poorly identified and/or because they were promising (hydrogen peroxide and peracetic acid are harmless to the environment or glutaraldehyde which is potentially very toxic to the bacterium).

One of the methods commonly used to determine the disinfectant power of a molecule is to determine its Minimum Inhibition Concentration (MIC) by adding a candidate molecule in an increasing concentration in a bacterial solution and observing its growth. If the bacterial culture continues to grow at such a concentration of disinfectant, it is because it is not sufficiently concentrated; If the bacterial culture does not grow, the concentration of disinfectant is sufficient. The lowest disinfectant concentration with the ability to block bacterial growth determines the MIC. Pretty on paper but this method involves a long contact time, several days, which does not correspond to the reality of the disinfectant treatments operated by the fish farmers (a few minutes to an hour, the eggs needing oxygen, they can’t survive without water renewal). While a disinfectant is sufficiently concentrated to inhibit bacterial growth over several days, one suspects that the bacterial population is destroyed before the disinfectant molecule is naturally degraded. However, due to the lack of information concerning the persistence of the disinfectant and the contact time necessary to destroy the bacterial population, we have chosen to propose an alternative method for estimating the anti-flavobacterial power of our panel of disinfectant products.

To determine the bactericidal power, we used a method based on sterilization schedules in industrial engineering : expose a population of F. psychrophilum to a disinfectant at a given concentration and follow the evolution of this population during a limited and known time (up to 40 min in our case, the upper range of disinfection durations allowed by fish farmers). This experiment gives us for each concentration the time necessary to decimate the population (to reduce a population to 1/10^th of what it was initially), this is called « decimal reduction time ». This allows us to propose a set of correspondences between treatment time and disinfectant concentration in order to obtain the same degree of destruction. It could of course be argued that the decimation of a bacterial population is far from being a complete disinfection, but the figures we have obtained seem to indicate that the processing intensities used in fish farming were below what is necessary to if only decimate populations of F. psychrophilum. Before determining treatment intensities required to reduce a population of F. psychrophilum a factor of 100 or 1000, it seemed more appropriate to test different treatment intensities on the viability of trout eggs.

For this, we made a very simple experiment : for each of the disinfectants of interest, we settled on a treatment time of 20 minutes corresponding to what is practiced in the field and chose three different concentrations : a suboptimale concentration closed of that currently used in the industry, a concentration which corresponds to the intensities of treatment which we have previously determined and an exaggeratedly high concentration which we thought to be deleterious for the trout eggs. After treatment, we let the eggs develop and, after hatching, let the larvae become fry and begin to feed. The aim of the game is to be able to observe any malformations.

The result is that the trout eggs are incredibly resistant : they have of course survived the weakest treatments (already known for their safety against eggs since used in the profession), the new treatment conditions but also the most violent intensities of treatment. Only one disinfection treatment performed with glutaraldehyde still had a negative impact ; a result to be weighed since I suspect that the effectiveness of the post-disinfection rinse improves the survival of the eggs. If we had to expect a 10% lost for the eggs with a violent but punctual treatment to reduce the subsequent prophylactic treatments and but completely abolish flavobacterial transmission, it could be worth the money, no ? But it remains to be proved, it is only a personal opinion. However, other highly concentrated disinfectants do not affect the survival of the eggs and do not cause malformation or weight variation (which is not indicated in the article but has been verified). This is interesting for the profession, which now knows that they benefit from a greater margin of maneuver (technical if not administrative) for these disinfection treatments with substances not harmful to the environment such as hydrogen peroxide or peracetic acid.

The less obvious but no less interesting accomplishments of this work

If the main results are the development of more effective and safe anti-flavobacterial treatments for eggs and subsequent fry, I would now highlight three points of research that I find interesting.

The more trivial it is the realization of incubation compartments for eggs and fry. They haven’t been bought somewhere but rather imagined and built by Michel Le Hénaff and Alain Rives from Bordeaux Sciences Agro. Based on the dimensions of a model used in fish farming, they ensure optimal water flow and can hold 200 which eggs/larvae in each compartment knowing that each incubation device contains six compartment. This very usefull device has allowed us to test an optimal number of repetitions in a reducted space and in similar conditions : we got a better reproducibility during our experimentation in fish farm without taking an excessive space in this said farm. This is not an empty word when we consider that the participation of fish farms have been done on a voluntary and benevole basis. It could be a pity that such a device does not benefit to the community in other types of experimentations.
The other achievement is the EMA-qPCR viability test that we have developed to monitor the survival of Flavobacterium psychrophilum exposed to various biocidal treatments. We did not invent the technique, far from it, it dates from at least 2006, but the setup was hard and I’m better positioned to talk about it because I realized it as well as the subsequent assays. This technique uses ethidium monoazide (EMA). This molecule is an intercalant that binds to DNA. Activated by a strong luminous intensity, it is permanently fixed to the DNA then cleaves it. If this property is combined with the fact that this molecule does not penetrate into healthy cells, it can be used to distinguish dead cells from living cells : if the cell is alive, the EMA does not enter the cell and its photo-activation has no impact, the DNA of the living cell remains detectable once it has been extracted. If the cell is dead or dying, the EMA enters the cell, binds to the DNA and the photo-activation leads to the degradation of the DNA that can no longer be detected. We have used well known PCR techniques that specifically detect and quantify F. psychrophilum DNA. We were criticized for not using a traditional quantification method of putting bacteria in culture and counting them. Especially since the sophisticated technique we used is more expensive. It is a debate of fifteen years now, the techniques of enumeration are robust and inexpensive and, although I’m a molecular biologist and rather inclined to use techniques always more innovative, I’m very sensitive to this kind of argument. But in practice, once developed, this technique of EMA-qPCR makes it possible to simultaneously manipulate a large number of small samples under the same conditions and to have the results for a disinfectant in the day. The protocol may potentially be adapted to quantify viability in somewhat particular cultures such as biofilms where the proportion of cultivable/non-cultivable bacteria is not necessarily ideal for conventional enumeration techniques. This technique seems promising, the only black spot is the need to do a fine tuning to each bacterial species tested.
The last interesting point of this work, besides the contributions for the fish farm, is the use of these famous sterilization scales, the determination of these decimal reduction times. It is used in the industrial environment for the development of methods of sterilization by heat for example. Or for enzymology, the preservation of the nutritional qualities of food products during their processing. Something quite exotic in the midst of ichthyopathology : a review article has recently been published on the various techniques and margins of optimization of techniques of disinfection of eggs and it does not emerge that this method of objectification of disinfectant properties of a chemical is particularly used or even known. Beyond this set of correspondences Duration of treatment/Concentration of biocide usable for fish farmers, this system gives us access to another value rather abstract at first sight but not devoid of interest : the value Z also called « parameter of thermoresistance specific to a microorganism ». In our case, this value could be called the « parameter of chemoresistance specific to a microorganism » (or one could continue to call it the value Z ?). Concretely, this value corresponds to the increase in concentration necessary to reduce the exposure time by 90% or to be 10 times more effective in the disinfecting power. Here is a fictive example : if we have a Z value of 100 g/L for a mysterious powder which destroys 90% of a yeast suspension in 40 min using 200 g/L, this means that if we increase this concentration by 100 g/L (= the Z value) so that the concentration is increased to 300 g/L, 90% of the yeasts are destroyed in 4 min instead of 40 min or 99% of the yeasts are destroyed in 40 min instead of 90%. Conversely, if the concentration of the powder is reduced to 100 g/l, it is known that it will take 400 min (~ 7 h) to remove 90% of the yeasts or, in 40 min we could have eliminated only 9%. This parameter Z being specific to a biocide and to a microorganism, it can also be exploited in two ways : for a given microorganism, it makes it possible to compare the disinfecting power of different molecules. Thus, in the article, it is shown that Incimaxx (peracetic acid) is much more aggressive than hydrogen peroxide whereas they both function in the same way on the bacterium. The corollary is that it also means that if you make a little mistake making the hydrogen peroxide solution, it will have less impact than by handling Incimaxx. The other utility of this data is rather for research : for a given disinfecting molecule, one can compare the chemoresistance of different microorganisms or even several strains of the same species (eg. a F. psychrophilum strain isolated in royal salmon, a strain isolated in ayu, another on rainbow trout, etc.). This would allow us to phenotype these strains, that is, to describe the specific characteristics of a strain. As with the genetic typing (genotyping), this kind of information serves to better understand the evolution of an organism and its adaptation to its environment and its host. Better understand the pathogen to better fight it. And all these « sterilization scales » can be useful for diseases other than flavobacteriosis in fish, but it can also be used for human health, agri-food, oenology, herbicides and so on. Any study to characterize the impact of a factor/treatment on a population (eg. impact of the installation of a software on a computer park on the prevalence of viruses/spyware, comparison of the impact of prevention campaigns on the prevalence of smokers or road accidents, etc.). Out of my field of expertise, I suppose that methods of objectivation of the same kind are used in one way or another…

To conclude on this post that begins to be longer than the original article. I hope I have achieved the main goals that I set myself : explain my job to my more or less close surroundings (family, friends, former colleagues or various contacts) in a sufficiently precise manner with the risk to produce a rather dense text, make visible our research (i.e. both explain the content of my CV and expose the work of this team of Bordeaux Sciences Agro) and can bring the light on certain aspects of fish farming, to which farmers may face and how research can meet some of their needs. I should mention that these works are indeed applied research, these are preliminary experiments, not industry practice consisting in flooding the rivers of France with hectoliters of glutaraldehyde… I specify once more than this article is not an infomercial in the aquaculture sector or even Bordeaux Sciences Agro…

In the future, I would do the same type of item on my previous work (PhD, post-doc) with a limitation is that I can not discuss precisely about unpublished work (and there are quite a few from 2005 to 2016). The Flavobacteriosis project is wider than disinfection treatment, there have been other results that we are still working on or that are exploited in other ongoing projects. As we say it in french : I can’t go faster than the music…

Mon avis sur Researchgate

Aujourd’hui, une fois n’est pas coutume, je vais parler boulot. Un peu. Voici mon avis sur Researchgate (mon profil), un réseau social professionnel pour les scientifiques.

Comme tous les chômeurs et les travailleurs précaires le savent (intuitivement ou grâce à diverses formations), pour trouver sa pitance de nos jours, il vaut mieux soigner son réseau professionnel : pour être visibles aux yeux d’éventuels employeurs ou tout simplement avoir accès au marché caché de l’emploi (les offres qui ne passent pas par une annonce). C’est pour profiter de ces besoins qu’on été créés les fameux réseaux sociaux dits professionnels que sont LinkedIn (mon profil) et Viadeo (mon profil). Le premier étant plutôt international et le second franco-français.

Dans le domaine de la science (en biologie mais je me doute que ce doit être la même salade pour les autres sciences), l’établissement d’un réseau professionnel est vital et pas seulement pour les précaires : même s’il y a indéniablement une concurrence entre laboratoires (pas seulement internationale, pas seulement nationale mais parfois aussi au sein d’une même institution voire d’un même bâtiment), la recherche est basée sur l’échange d’informations (échanges de trouvailles pour qu’untel n’ait pas à refaire une recherche qui a déjà été faite et pour enrichir le corpus de connaissances), échanges de compétences (pour venir à l’aide d’un collègue dans la difficulté mais surtout pour mutualiser les moyens, partageant ainsi les tâches d’un gros projet qu’un chercheur isolé ne pourrait pas mener tout seul).

C’est tellement vital pour un laboratoire que parmi les critères d’embauche pour des postes fixes, le réseau que s’est constitué le candidat pendant sa précédente carrière est primordial. Je développe.

Ce qu’on appelle la fuite des cerveaux pour le commun des mortels est en partie un abus de langage dans le domaine scientifique : s’il y a effectivement des gens qui partent à l’étranger et qui n’en reviennent pas, pour les autres, il faut plutôt voir cette courte carrière à l’étranger comme une sorte de compagnonnage. On a beau avoir un BAC+8 et le titre de docteur, être spécialisé dans un domaine très pointu, le jeune docteur doit encore faire ses preuves pour être considéré en tant que tel. Parce qu’il ne maitrise pas forcément à fond tous les aspects des techniques qu’il a utilisées pendant ses travaux de thèse, parce qu’il est loin de maitriser le domaine de la biologie pour lequel il a pourtant été diplômé (c’est le travail de toute une vie ou au moins d’une décennie) mais peut-être aussi parce qu’il n’a eu le « déclic » pour la recherche que tardivement (pendant ces 8 années d’études, on est longtemps un étudiant, un récipiendaire de connaissances, les 3 dernières années sont l’occasion de prendre du recul pour exploiter ses connaissances et ses acquis en méthode de travail pour devenir un producteur de connaissances, professionnel qui plus est. Tout le monde n’arrive pas à prendre ce recul au cours de ces 3 années, à acquérir la confiance en soi nécessaire. Certains n’y arrivent jamais même avec le titre de docteur en main). La période dite postdoctorale (postdoc) est donc l’occasion pour le jeune docteur de confirmer sa vocation ou d’en changer. Mais pas seulement. Ce qui titille l’employeur, qui appâte le jury de concours de la fonction publique, ce ne sont pas seulement les connaissances et compétences acquises mais surtout le réseau professionnel que le jeune docteur a pu constituer : des chercheurs devenant ainsi plus facilement accessibles pouvant proposer nouvelles compétences, nouvelles connaissances, matériel autrement inaccessible, meilleure visibilité, accès à d’autres réseaux, etc. Une nouvelle recrue enrichit ainsi son laboratoire d’accueil du réseau de relations qu’il a constitué auparavant (et qui dépasse souvent le cadre scientifique soit dit en passant).

Le scientifique se sert traditionnellement des congrès et divers séminaires pour réseauter : on assiste à des conférences présentant les travaux d’untel, on discute avec lui de ses travaux cacahuètes et whisky-coca à la main et on s’envoie ensuite des emails pour planifier une réunion pour le futur projet commun, etc. Complémentairement à cet espace de rencontres, il y a donc l’utilisation de réseaux sociaux professionnels qui se sont développés ces dernières années (en réaction à Facebook réservé à la sphère privée ?). Je parlais plus haut de Viadeo, le réseau français qui est parfois très actif selon le domaine concerné : je n’y ai que quelques collègues qui s’y sont perdus et dont les profils végètent à l’instar du mien alors que d’autres qui travaillent par exemple dans le secteur Marketing reçoivent des offres de chasseurs de tête plusieurs fois par mois. Je pense que ce doit être « The Place To Be » quand on bosse dans le tertiaire. LinkedIn a une vocation plus internationale et c’est probablement pour ça que j’ai pu retrouver là-bas bon nombre de mes collègues et anciens collègues. Malheureusement, ces sites partagent les mêmes défauts : ils sont encore trop généralistes, trop payants, ont un système de liste de contacts old-school (cf. Facebook) au lieu de liste de followers qui n’engagent à rien (cf. Twitter ou Diaspora*), sont pourris de diverses sortes de spam (soit par emails, soit des sujets de discussions bidons pour attirer le chaland sur un blog ou autre). Il n’y a finalement pas tant d’intérêt que ça à s’y maintenir au-delà d’un profil qui fait office de CV.

Researchgate propose autre chose, je vais essayer de détailler ce que j’ai apprécié (ou non) :

Liste de contacts flexible : Comme sur Twitter ou Diaspora*, on se contente de suivre nos contacts préférés. Nos collègues et autres connaissances mais aussi les chercheurs avec qui on n’a pas eu de contact mais dont on veut suivre la production scientifique et/ou le parcours professionnel. Pas besoin d’avoir une confirmation de l’autre. On peut aussi bloquer qui on veut mais dans la mesure où il n’y a pas d’informations confidentielles qui sont diffusées, je trouve ça un peu puéril…

Populaire parmi les scientifiques : Ca parait un peu vain comme argument mais on est bien d’accord que la force d’un réseau social ce n’est pas forcément les atouts techniques qui sont proposés mais l’ampleur et la nature de la communauté qui le peuple. On a bien l’exemple du réseau Diaspora* qui a beaucoup pour plaire mais qui est dépeuplé donc inutilisable pour un réseau optimal. Personnellement, c’est sur Researchgate que j’ai retrouvé le plus de collègues. La grande majorité de ceux qui n’y sont pas ne sont pas non plus sur les autres réseaux professionnels (probablement parce qu’ils sont allergiques au concept).

Accès à la bibliographie : En fait, le squelette de ce réseau social n’est pas la communauté scientifique mais la communauté des auteurs de publications scientifiques. Ces publications forment donc l’architecture du système. Pour chaque profil, nous avons accès aux publications scientifiques (et conférences) relatives à cette personne et à côté de ça, il y a bien sûr un moteur de recherche pour trouver les publications d’intérêt. Pour les revues qui fonctionnent en Opendata, on a la plupart du temps directement accès au fichier PDF (mais on peut l’avoir ailleurs, comme depuis Pubmed ou le site de l’éditeur, ce n’est pas un exploit) et pour les revues qui ne sont pas en Opendata, les auteurs peuvent prendre l’initiative (illégaaaaale !!!) de mettre quand même les articles en téléchargement. Sinon, plus intéressant encore, on peut demander en un clic (et sans blabla) aux auteurs de nous envoyer directement le pdf en message privé. Les institutions publiques comme l’INRA et le CNRS proposent à leurs employés l’accès à plein d’abonnements mais ça ne concerne que 90% des éditeurs (chiffre arbitrairement choisi pour signifier qu’ils n’ont pas accès à tout). Il arrive qu’on ait besoin d’un article publié dans une revue un peu confidentielle (ou qui n’existe plus) et on a alors toutes les difficultés à l’obtenir. Il existe un groupe sur Facebook où n’importe qui peut demander aux autres membres de leur filer tel ou tel article mais dans ce groupe non plus, on n’a pas forcément accès à tout. Research Gate est sérieusement un Gmoyen complémentaire et facile d’utilisation pour accéder à tout type de publication scientifique. C’est à mes yeux un des avantages les plus importants du réseau (parce que j’ai eu accès à une poignée d’articles impossibles à avoir alors que j’ai pourtant accès à des abonnements institutionnels et au fameux groupe Facebook). Dans la vraie vie, il existe un moyen ultime pour avoir une publication, c’est de demander directement à l’auteur principal (le « corresponding author » comme on dit) mais ça implique souvent de se présenter, de se justifier, de sortir l’arsenal adéquat de politesse (pas le même si on a affaire à un américain ou un allemand…) ce qui peut en rebuter certains au point de ne se lancer dans cette démarche que pour les articles « vitaux ». Sur Researchgate, c’est l’affaire d’un clic.

Communauté Researchgate riche et réactive : il y a donc beaucoup de monde et un système de questions/réponses (Q/A) un peu comme sur Ask.fm. On peut s’abonner à des sujets (topics) et aux questions qui y sont associées. Si on choisit un topic un peu généraliste, ça devient vite n’importe quoi et si au contraire on choisit un topic un peu confidentiel, c’est le désert. Mais de toute manière, on peut naviguer dans les topics et les Q/A auxquels on n’est pas abonné. Il y a une fonctionnalité qui présente à mes yeux un très fort potentiel mais je doute qu’elle soit utilisée : on peut discuter autour d’un article ! Je trouve que c’est une fonctionnalité qui manque dans le monde scientifique du moins dans la biologie : l’aspect Web 2.0 qui permet de pouvoir commenter/réagir/se renseigner à propos de tel ou tel point abordé dans une publication. Actuellement, les échanges ont surtout lieu lors des conférences et par email, il y a une limitation dans le temps (10 min de questions) et l’espace (il faut être à la conférence) ou au niveau du public (l’email, c’est du peer to peer…et on partage pas l’échange avec d’autres). Cette fonctionnalité est donc l’opportunité d’avoir des précisions et de les partager avec ceux que ça pourrait potentiellement intéresser dans le futur mais elle permet aussi de mettre en avant certains questionnements : j’imagine bien des échanges autour de l’article de Seralini (celui qui a fait bouffer du maïs roundup à des souris) avec des réponses de Seralini ou le reste du staff voire les éventuels collaborateurs. J’imagine aussi des tas de digressions sur telle ou telle hypothèse abordée dans tel article : avec des gens qui ne vont pas forcément aux conférences adéquates ou qui viennent soulever un point bien après la publication de l’article. Franchement, je suis persuadé que faire de la science sans interactivité sur le net, c’est se mettre une balle dans le pied (ou plutôt un boulet à la cheville). Il y a un hic cependant : normalement, quand une publication est acceptée dans une revue, les résultats et hypothèses abordées sont quasiment entérinées pour la postérité. Un système d’interactivité tel que celui que propose Researchgate est une atteinte à ce pantouflage institutionnalisé et je soupçonne que si elle n’est pas trop utilisée en ce moment, c’est à cause de ça : « tu ne me poses pas de question gênante, je ne t’en poserais pas non plus » mais je reste persuadé qu’un jour où l’autre, la barrière mentale sera franchie. Pour le bien de tous.

Gratuité : y a rien de directement payant ni d’option ou abonnement premium à la con comme Viadeo ou Linkedin.

Visibilité des thèses : Un doctorant produit des publications scientifiques mais plus souvent un gros manuscrit qui n’est normalement lu que par quelques initiés (collègues du labo de thèse et quelques collègues de collègues). RG permet de publier les thèses et les rendre accessibles pour tout un chacun. Avantage certains pour ceux qui ont publié en anglais.

Pour l’instant, je ne vois pas d’autres points forts (ou du moins qui ne tiennent pas du simple gadget). Voici les points noirs :

Notifications trop abondantes : il y a plein de types d’alertes email activées par défaut (pour nous fidéliser et nous faire venir plus souvent, faire du clic). Mais on peut les désactiver plus facilement que sur un compte Facebook (et c’est respectueux de ces choix).

Business model un peu foireux : Si j’ai bien compris, c’est basé sur la publicité avec des encarts ici et là et sur le service lié aux offres d’emploi. Les pubs, c’est has been qu’on le veuille ou non (grâce à Adblock, Trueblock et compagnie) et payer pour promouvoir une offre d’emploi, seuls les plus riches institutions peuvent le faire. Je ne sais pas si c’est très porteur et je me demande donc si les revenus de Researchgate ne proviennent pas essentiellement de cette fameuse publicité. Et comme je suis persuadé que ce n’est pas durable, je pense qu’ils monétiseront probablement leur site d’une autre manière à plus ou moins long terme.

C’est centralisé : C’est comme Facebook, si t’es pas content des conditions d’utilisation, tu pars. Etant donné que c’est un site allemand et que les allemands semblent marcher les mains dans la main avec le NSA d’après les développements post-Snowden, ça signifie que les messages privés sont potentiellement « espionnables ». Ce n’est donc peut-être pas le meilleur endroit pour aborder les recherches sur le nouveau projet de brevet de l’équipe. Ceci dit, je pense que ce genre de site est indispensable pour la communauté scientifique (et pour les amateurs de sciences) et s’il est amené à fonctionner aussi bien que je le pense, il fera des petits de type Diaspora*.

C’est élitiste : Je pense que le système n’est pas propice pour ceux qui n’ont pas de publication, c’est à dire pour les techniciens (qui sont pourtant tout aussi demandeurs de bibliographie), pour ceux qui font de la publication grise (même s’il y a moyen de transmettre sur RG les publications et jeux de données qui ne sont pas passés par un jury) et tout simplement pour les étudiants/passionnés autodidactes : Publish or perish, c’est la règle sur Researchgate. Personne n’ira répondre à mamie si elle décide de s’inscrire et de poser quelques questions ici et là.

C’est basé sur le facteur d’impact (Impact Factor pour les intimes) : Pour ceux qui ne connaissent pas le système, un scientifique publie ses résultats dans une revue à comité de lecture (qui valide ou pas si l’article est accepté pour publication). Dans un article, on cite nos sources (articles dans d’autres revues), chaque revue est notée en fonction du nombre de fois où ses articles sont cités. Chaque année, il y a la publication de cette notation : les facteurs d’impact par Thomson Reuters. Les biologistes du public sont notés (dans la vraie vie) en fonction du nombre de publications et de leur facteur d’impact. L’enjeu « quotidien » est d’avoir un résultat tellement inédit et d’une telle qualité qu’on puisse le publier dans une revue de renom. Researchgate a fait le choix de classer les membres de son réseau en fonction d’un nombre, le RG score, qui dépend beaucoup du facteur d’impact total des publications de chacun. Ca a de nombreux biais notamment parce que le facteur d’impact moyen d’un scientifique varie en fonction du domaine de prédilection : généralement les publications de médecine ont un facteur d’impact assez haut. Je sais qu’à l’INRA, il y a des coefficients différents en fonction des domaines d’application mais c’est un système interne à l’INRA. En plus de ça, j’ai cru lire qu’il y avait d’autres biais dans d’autres domaines : dans l’informatique, ce qui compte le plus apparemment ce sont les conférences et on ne publie généralement dans des revues que les résultats qui ne sont pas intéressants (j’ai lu ça là). Researchgate reproduit donc un biais majeur de l’évaluation du travail scientifique. Je me console en voyant qu’il y a d’autres critères mineurs qui peuvent changer la donne (participations aux Q/A, taille du réseau, liens avec co-auteurs, etc.) et surtout, ce site peut devenir un laboratoire dans le domaine en utilisant d’autres indices d’évaluation et d’autres opportunités de réseautage, d’autant plus facilement qu’il doit y avoir des chercheurs dans ce domaine qui participent au réseau ^^

Absence de blog : Contrairement aux autres réseaux sociaux de ma connaissance (Diaspora, Facebook, Twitter, Linkedin ou Viadeo), Researchgate ne propose pas de fil d’annonces personnalisées. Je ne sais pas si c’est un choix technique (ça doit bouffer des ressources sur le serveur) ou éditorial (parce que c’est aussi une source potentielle de spam). En tout cas, ça empêche de diffuser rapidement certaines informations et c’est d’autant plus dommage que ce genre de mur/blog permet est souvent l’occasion de se coordonner avec d’autres réseaux (Twitter pour ne parler que de lui). Je pense que je ne suis pas le seul à m’être posé la question et il faudrait que je fouille dans la zone Feedback pour voir ce qu’il en est.

En conclusion, j’ai trouvé dans ce site beaucoup d’éléments sympathiques qui ont déjà changé quelques trucs dans ma manière de fonctionner et je pense que les mauvais points de ce site ne sont pas rédhibitoires. Ce site a du potentiel et s’il capote, le concept du site est excellent. C’est parce que je le pense sincèrement que je me suis décidé à faire ce billet pour en faire la promotion. Je tiens à préciser que je n’ai rien reçu en échange d’un tel billet. J’invite les amateurs à y faire leur trou et à solliciter toutes les publications qui leur plaisent : la science n’est pas que l’affaire de professionnels, appropriez la vous.

Mise à jour du billet (25/10/2013) : Aujourd’hui, le vendredi 25 octobre de l’an de grâce 2013, j’apprends que Pubmed va lancer Pubmed Commons, un système qui va permettre de pouvoir commenter les articles scientifiques après leur publication. Le web 2.0 atteint enfin le domaine scientifique de manière plus sérieuse que ça ne l’était jusqu’à maintenant : parce que si Researchgate est effectivement le réseau social scientifique le plus gros, Pubmed (avec Web of Knowledge de Thomson Reuters) est beaucoup plus sérieux au niveau de la base de données de publications. C’est à mes yeux un retournement de situation assez majeur. Reste à voir si ce système sera utilisé (comme je le dis dans le billet ci-dessous, si le système de commentaires de publications existe sur Researchgate, il n’est pas utilisé).

Cependant Researchgate a un avantage sur Pubmed : il est pluridisciplinaire alors que Pubmed est orienté Biologie. De plus, RG propose déjà un réseau d’interactions (avec les listes de followers, avec les questions/réponses) mais si ce n’est pas évident pour Pubmed, il y a déjà un embryon avec le profil My NCBI où on peut référencer ses propres publications. Pubmed a du retard mais il peut être relativement facile à rattraper : ils ont déjà fait le plus dur, accumuler 22 millions de publications (sans compter les données de Genbank et compagnie).

Reste une inconnue, Web of Knowledge avec son système ResearchID (profil de chercheur avec publications associées et compagnie) : ils sont encore plus puissants (et pluri-disciplinaires) que Pubmed au niveau de la base de données de publications scientifiques et plus avancés qu’eux en terme de profil individuels/création de réseau pro.

Je sens que ça va être la guerre dans les prochains mois et que Researchgate va se faire bouffer tout cru.